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本制品为磷蛋白富集试剂盒。本制品基于亲和原理，适用于从哺乳动物细胞和组织中提取磷酸化蛋白质。

• 从细胞到样品纯化的平均时间少于2h，实验操作快速。
  
• 操作简单直接，只需4步便可完成磷酸化蛋白质纯化。
  
• 实验过程非变性，保证蛋白折叠构象。
  
• 每个纯化柱的最多可结合约为4mg磷酸化蛋白质。
  
• 适用于质谱和2D-PAGE等多种下游应用。
  
• 适用于任何类型的哺乳动物细胞，如NIH 3T3，Cos-7等。
  
• 本制品只能用于科研。

• 在预先称重的离心管中，用20倍体积的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤50～150mg细胞，以500×g的离心力离心5分钟，共洗涤三次。
  
• 洗涤后，按上述条件再次离心细胞，然后倒出上清液并吸去残留液体。
  
• 将离心管再次离心约2分钟，吸去任何残留的微量液体。然后重新称量离心管，以确定细胞沉淀的重量。
  
• 将样品置于液氮中或-80℃冰箱中冷冻。
  
• 将约100毫克的细胞沉淀重新悬浮于每毫克细胞30μL的磷蛋白提取液中6.轻柔吹打约20次来混匀沉淀。
  
• 在4℃下孵育10min，期间每分钟倒转试管一次。将细胞裂解液转移至微量离心管中。
  
• 将细胞提取物在4℃下以10000×g离心20分钟。在离心样品的同时开始准备柱子。
  
• 将上清液转移到干净的试管中，不要触碰到沉淀物。
  
• 将澄清样品的一部分保存在4℃，用于蛋白质测定和其他分析。
  
• 让柱子在室温下直立放置，直到树脂从悬浮液中沉淀出来。
  
• 拆下柱顶盖，然后是端盖，让储存缓冲液排出，直至与树脂床顶部齐平。
  
• 用5毫升蒸馏水冲洗柱子。
  
• 加入5毫升磷蛋白提取液，使柱子达到平衡状态，并让缓冲液流过。
  
• 重复第14步。
  
• 收集并测量最后2毫升流出液的pH值。如果pH值不小于或等于6.0，则继续用磷蛋白提取液冲洗。
  
• 用端盖封闭柱子，将澄清后的样品加入柱子中。
  
• 用顶盖封闭柱子。
  
• 将装有样品的柱子置于平台振荡器上，于4℃轻轻振荡20分钟，使磷酸化蛋白结合到柱子上。
  
• 让柱子直立放置5min，使树脂沉降。
  
• 拆下柱顶盖，然后拆下端盖，让未吸附的物质流出。如果需要分析非磷酸化蛋白，则收集这些未吸附的物质。
  
• 通过加入5毫升磷蛋白提取液并让其流过，清洗柱子。重复此洗涤步骤三次，总共四次5毫升洗涤。
  
• 加入1毫升磷蛋白洗脱液，并在冰上收集该部分。
  
• 每次用1毫升磷蛋白洗脱液重复步骤23四次（每次收集部分）。立即将所有部分储存在冰上。
  
• 进行BCA分析，以确定细胞提取物及洗脱部分中的蛋白质浓度。